如何计算每个基因的覆盖度与深度

　如何计算每个基因的覆盖度与深度，有多种方法可以完成。如下演示使用samtools depth命令方法

　　1. 数据下载

1.1 Fastq文件下载

　　从NCBI下载Illumina Hiseq X Ten平台的RNA-Seq数据SRR7751429信息如上图所示。

1.1.1 使用wget命令（sra-toolkit工具下载太慢）下载

wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR775/SRR7751429/SRR7751429.sra

1.1.2 在SRA Toolkit工具页面根据不同操作系统进行下载（例如，我的是编译好的Centos 64位）

1.1.3 使用SRA toolkit工具将SRR7751429.sra数据转成fastq格式

fastq-dump -split-3 SRR7751429.sra

1.2 基因组及注释文件下载

　　人的参考基因组文件（版本GRCh38）下载

wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa.gz
# 解压
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa.gz

　　人的gtf注释文件下载

wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.93.gtf.gz
# 解压
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.93.gtf.gz

　2. 生成bam文件

　　因为是演示，只需要生成bam文件，我这里就用bwa比对了，节约时间。

# 创建索引
bwa index /home/Ensembl/Animal/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.dna.all.fa
# 比对
bwa mem -t 32 -M /home/Ensembl/Animal/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.dna.all.fa SRR7751429_1.fastq SRR7751429_2.fastq -o SRR7751429.sam

　3. 基因CDS（编码区）获取

3.1 本地获取基因cds信息

　　下载的Homo_sapiens.GRCh38.93.gtf文件包含有基因exon、cds、3‘utr、5‘utr等相关的物理位置信息，获取基因CDS信息只需解析该文件就可以了。（有需要的话，后续跟新相关脚本）

3.2 使用ensembl获取cds信息

　　

　　如上图所示，以人BRCA2基因为例，搜到后点击CCDS，出现该基因的物理位置信息。然后，将该信息复制粘贴，以如下图所示格式储存于文件BRCA2.bed中。

　4. 使用samtools工具进行统计

　　samtools工具是对SAM/BAM文件进行操作的软件，其带有多种统计相关的命令及SAM↔BAM格式转换的命令。

4.1 SAM文件格式转换为BAM文件格式

samtools view [email protected] 16 -bS SRR7751429.sam -o SRR7751429.bam

4.2 sort BAM文件，然后建立BAM文件索引

# sort BAM文件
samtools sort [email protected] 16 -o SRR7751429_sorted.bam SRR7751429.bam

# 索引BAM文件
samtools index [email protected] 16 SRR7751429_sorted.bam

4.3 使用depth命令计算bed文件区域中每个位点的深度

samtools depth  -b  BRCA2.bed SRR7751429_sorted.bam >BRCA2.bed.depth

　　一共得到3列以指标分隔符分隔的数据，第一列为染色体名称，第二列为位点，第三列为覆盖深度。

4.4 根据bed文件和深度文件来统计大于10×的区域占总CDS区域比例

# -*- coding: utf-8 -*-
from __future__ import division

import csv

# 定义cds文件名路径
cdsfh = ‘BRCA2.bed‘

# 区域长度
cdslen = 0


with open(cdsfh,‘r‘) as f:
    cf = csv.reader(f,dialect=‘excel-tab‘)
    for row in cf:
        # 读取每一行区域
        chrom,start,end = row
        length = int(end) - int(start) + 1
        # 迭代所有的cds区域长度，得到基因cds区域全长
        cdslen += length


# 定义深度文件名路劲
depthfh = ‘BRCA2.bed.depth‘

# 大于10X区域长度
gt10len = 0

with open(depthfh,pos,depth = row
        # 判断覆盖度是否大于10X,是的gt10len就自增1
        if int(depth) > 10: gt10len += 1


# 计算编码区大于10X的区域占总编码区的比例
percent = gt10len / cdslen * 100

# 输出
print("%.2f%%" % percent)

　　上述脚本只能针对单个基因，若是多个基因，可结合shell循环实现。

参考资料

samtools

ensembl